完全人源的基因编辑技术—锐湃尔®(REPERE®),已实现通过于体外转录产生RNA并于体外结合ORF1p和ORF2p形成RNP后转入人源细胞并对其进行基因编辑,将外源序列有效并准确的插入至人源细胞基因组中相应靶位点处。
例:一段外源性序列及靶位点的上下游序列连接经改造的Alu序列,该序列在体外经T7启动子转录产生RNA后,于体外结合ORF1p及ORF2p后导入Hela细胞,通过锐湃尔®(REPERE®)技术将其插入至Hela细胞的Lman1基因中的靶位点。qPCR结果显示:
| Ct值 | GAPDH | 待插入序列插入 | ΔCt | ΔΔCt(实验组ΔCt平均值-对照1组ΔCt平均值) | 拷贝数相对量(2-ΔΔCt) |
| 对照1组板1 | 26.23 | N/A | 13.77 | – | – |
| 对照1组板2 | 26.14 | N/A | 13.86 | – | – |
| 对照1组板3 | 25.80 | N/A | 14.20 | – | – |
| 对照1组平均值 | 13.94±0.19 | 0.00±0.19 | 1.00(0.88-1.14) | ||
| 实验6组板1 | 25.72 | 26.45 | 0.73 | ||
| 实验6组板2 | 26.08 | 26.19 | 0.11 | ||
| 实验6组板3 | 26.33 | 26.59 | 0.26 | ||
| 实验6组平均值 | 0.37±0.26 | -13.57±0.26 | 12161.22(10155.69-14562.80) |
Lman1基因为凝血因子V和VIII联合缺乏症(F5F8D)的致病基因,其突变可导致人FV和FVIII水平降低,患者可表现出自发性出血症状。
该结果显示了锐湃尔®(REPERE®)技术的基因编辑能力,同时体外转录(IVT)产生RNA及结合有ORF1p及ORF2p的RNP在提供更简便、高效和安全的给药方式的同时,亦为未来的工业化生产提供了可能。